BioSite forsiden

Indhold i box-in-a-box-4b

Tyndtlagskromatografi

Bookmark and Share

Udskriv

Andre navne: TLC, tyndtlagschromatografi. (Eng.: Thin layer chromatography, TLC)

Tyndtlagskromatografi eller TLC er en kromatografisk seperationsteknik som består af en plade som kan være af glas eller kraftigt aluminiumsfolie. Den ene side af pladen er dækket (coated) af et pulver som kan have forskellige egenskaber alt efter hvilke stofklasser man vil adskille. På den nederste del af pladen markerer man nogle påsætningspunkter, sædvanligvis med en blød blyant, hvor man med en mikropipette kan påsætte opløsninger af de stofblandinger man vil separere. TLC plader kan have forskellige størrelser fra 2x6 cm op til 20x20 cm.

TLC kan anvendes på mange forskellige stofblandinger som fx farveblandinger, aminosyrer, lipider, alkaloider og mycotoksiner.

Teknikken er ret simpel, på den nederste del af pladen pådrypper man opløsningen af de stoffer man vil separere. For at have noget at sammenligne med så pådrypper man også nogle opløsninger af standarstoffer som man har mistanke om befinder sig i den ukendte blanding. Når pletterne er tørre sætter man pladen ned på højkant i et bægerglas (TLC-kar) eller en anden passende beholder hvori man forinden har hældt en lille mængde af et passende opløsningsmiddel (solvent). I løbet af få minutter har opløsningsmidlet bevæget sig op ad pladen, når opløsningsmidlet er ca 1 cm fra pladens øverste kant tager man pladen op og markerer hurtigt væskeforntens position med en blød blyant (det er det der i C og D er markeret med "front").

Bægerglasset skal være forsynet med et låg og et stykke filterpapir skal dække indersiden af bægerglasset. Låget skal være på for at sikre at opløsningsmidlet ikke fordamper og skal sammen med filterpapiret sikre at luften i TLC-karret er mættet med dampene af opløsningsmidlet. Dette sikrer at udviklingen (elueringen) af TLC-pladen går hurtigere.

Nedenfor ses et eksempel på TLC adskillelse og identifikation af en farveblanding. (A + B) I startpunkterne 1,2, 4 og 5 er påsat farveprøverne rød, violet, blå og gul. I positionen i midten (nr 3) er påsat den farveblanding man ved separere og identificere de enkelte farvestoffer der indgår i blandingen. I (C) er pladen færdigudviklet og taget op af TLC-karret og tørret. Pletterne har bevæget sig op ad pladen med forskellig hastighed, den røde har nået længst mens den gule knapt har flyttet sig fra start. Den blanding (grønne farve) der blev påsat i punkt 3 ses nu at indeholde to farver: En blå og en gul.

Forskellige stadier af tyndtlagskromatografi (klik på billedet for større opløsning)

Tyndtlagskromatografi - klip på billedet for at se det i større format

For at sammenligne pletternes løbelængde anvender man Rf-værdier. Rf-værdierne bestemmes ved at måle pletternes løbeafstand fra start til centrum af den enkelte plet og dividere denne længde med væskefrontens løbelængde. Eksempelvis vil Rf-værdien for den blå plet i figuren beregnes som d/a. Med Rf-værdierne kan man for det samme stof sammenligne løbelængden mellem forskellige TLC-plader.

Todimensional TLC kan bruges ved mere komplekse blandinger som skal separeres, her lader man først TLC-pladen udvikle i en solventblanding som fx adskiller de polære komponenter i blandingen, efter udviklingen tørrer man TLC-pladen. Derefter vender man TLC-pladen 90 grader og udvikler pladen i en solventblanding som adskiller de upolære komponenter i blandingen.

TLC kan også anvendes til oprensning af større mængder stof idet man kan anvende præparativ TLC som egentlig udføres som sædvanlig TLC men med plader med et meget tykkere lag pulver. På disse plader kan man pådryppe større mængder ikke blot som pletter men som striber hen ad pladen. Herved kan man adskille større mængder stof. Når pladen er færdigudviklet afskrabes det bånd på TLC-pladen som indeholder det stof man er interesseret i og eluerer stoffet ud med et passende opløsningsmiddle, fx vha et Soxhletekstraktionsapparat.

Detektionsmetoder. Det er langt fra alle stoffer der kan ses på en TLC-plade, faktisk er de fleste stoffer farveløse. For at kunne se stofferne på en TLC-plade må man behandle pladen med stoffer som farver stofferne på pladen. Farvningen foretages som regel ved at spraye pladen med reagens opløst i et passende opløsningsmiddel, da de ofte er ret reaktive kemikalier der anvendes skal farvningen foregå i stinkskab.  Farvemetoderne kan inddeles i nondestruktive og destruktive. De nondestruktive, som ikke ødelægger stofferne på TLC-pladen, kan fx være UV-lys, ioddampe eller vand-spray. De destruktive, som ødelægger stofferne, kan eksempelvis være charring (forkulning) med koncentreret svovlsyre eller ninhydrin farvning.

TLC anvendes i dag ikke så ofte, men teknikken har den fordel at den er meget billigere at anvende end væskekromatografi og gaskromatografi som begge kræver en større investering i apparatur, forbrugsvarer og arbejdsindsats.

Indhold i box-in-a-box-5

BioSite 20/1,10; 28/2,10

Indhold i box-in-a-box-6b
Mentiqa Odense

Politik til beskyttelse af personlige oplysninger

Box 10
Box 11
Box 12
Box 13